对虾急性肝胰腺坏死病PCR检测方法免费公开
2018/4/26 15:11:56

   以泰国T.W.Flegel教授以及台湾罗竹芳教授为首的研究人员已经公开确定引起急性肝胰腺坏死病(hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)的那株特异性副溶血性弧菌的PCR快速检测的方法,并且公布了检测方法的PCR引物以及反应方法。

  

  前言:

  

  在泰国,实验由Centex Shrimp (泰国玛希隆大学杰出人才中心对虾研究组)、玛希隆大学公共卫生部和水产养殖企业研究中心部、水产科学研究院、农业大学等多名研究人员完成的。自2011以来,这项工作得到了农业研究发展机构、台湾国家科学委员会等多个机构的资金支持。

  

  2013年12月5日,研究人员通过获得的基因序列的对比信息,参照对比信息可以测试不同的PCR检测方法,他们花了近20天的时间来验证不同的PCR检测,并公布了他们认为最好的检测方式。

PCR  操作:

  预热 : 94°C, 5min

  PCR 25~30 cycles with:

  变性 : 94°C, 30 sec

  退火 : 60°C, 30 sec 

  延伸 : 72°C, 60 sec 

  后延伸 : 72°C, 10 min

  扩增产物  : ~700 bp

  

  AHPND 引物组1 (AP1) 

  AP1F:- 5’- CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATG -3’  

  AP1R:- 5’- GCAAACTATCGCGCAGAACACC -3’ 

  AP1扩增产物为700 bp

  

  AHPND 引物组2 (AP2)  

  AP2F:- 5’- TCACCCGAATGCTCGCTTGTGG -3’ 

  AP2R:- 5’- CGTCGCTACTGTCTAGCTGAAG -3’

  AP2扩增产物为700 bp



正文如下:

  

  目前,养虾业在亚洲的经济局势非常严峻,由对虾死亡和停止养虾造成的经济损失非常大。我们相信及时公布检测方法,降低AHPND暴发风险的所获得的收益,远远比从检测产品中收到的专利费用以及我们研究所需要的费用要多。如果要申请专利,还需要推迟几周甚至到几个月的时间用来准备文件,以及准备足量的商业检测试剂盒投入市场,以满足市场需求。我们无法预测推迟几天、几周甚至几个月里,将造成的潜在市场经济损失。

  

  基于以上诸多因素,我们决定公开AHPND的PCR检测操作方法,允许这些信息更为广泛、迅速的传播,以减少暴发AHPND的风险。

  

  虽然我们已经做了大量测试,但由于样本数还是有限的,简单地说,我们发现以下几个情况:

  

  1、这两对引物检测了68个样品,两对引物检测67个样本的检测结果是一致的。

  

  2、从粮农组织在越南用于研究宏基因组学分析收集的对虾肝胰脏组织(每个池塘10虾)的14个样本中,其中8个样品具有积极的AHPND病理特征,但PCR检测结果显示5个为阳性结果3个为阴性结果(两对引物检测显示结果);而5个样品的AHPND病理特征不明显的,两对引物PCR检测结果均为阴性结果。

  

  3、68个测试样本中分理出5株副溶血弧菌的AHPND样本中,并通过生物鉴定都可以导致AHPND病变,其中有3个样品是在2002年在对虾底泥中分离得到的弧菌,并被证实并不会引起暴发AHPND(两对引物检测结果显示呈阴性),另外2株在水体及虾体取得的样本,尚未进行生物测试。

  

  4、有一个弧菌生物测定不会导致AHPND的组织病理,但是养殖过程中的却造成高死亡率并伴随着肝胰腺组织病变症状,两对引物PCR检测结果均为阳性。

  

  5、新分离的瓦氏菌(Shewanella)、红球菌(Rhodococcus)、赖氏细菌(Leifsonia)、戴尔福特菌( Delftia)、青枯菌(Ralstonia)、创伤弧菌(V. vulnificus)、哈维氏弧菌( V. harveyi)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和枯草芽孢杆菌(B. subtilis)的两对引物检测结果为阴性。

  

  至此,我们不能保证所阐述的方法与每个可能的非AHPND细菌的样本或者其它有机体没有交叉反应。我们也不能保证这种方法能检测出每一株可能引起对虾AHPND的细菌。我们也邀请所有行业人员,帮助我们进行进一步的验证、改进这个检测方法。

  

  我们初步的序列拼接和序列比较分析表明,我们已经确定了的目标序列来自细菌的质粒DNA并不是来自于AHPND菌株的染色体DNA。如果这个假设被证实,这也将影响AHPND有关的毒力传导机制。然而确定毒素所需的时间目前还无法确定。由于情况紧急,我们决定发布PCR检测引物序列信息,它将作为一个临时检测工具,直到毒素被确定。


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